Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system
Cas9经过斑马鱼密码子优化
sgRNA的选择5‘端带有GG的靶点：BsmbI酶切位点，切点在酶切位点序列外侧，形成粘性末端。
使用的是nls-zCas9-nls的mRNA进行注射，改变gRNA的量，可以减少突变率，使得高突变（biallelic mutation-like）造成的胚胎致死存活至成体。
本研究中，在F0存在高的突变效率，结果是F0的杂交F1为biallelic-纯合突变。测序结果表明存在部分in-frame的indel，可以通过设计位点在关键序列区域使蛋白功能缺陷。
脱靶检测
- 保留种子序列，对非种子序列不同错配数的预测脱靶位点。
- 不同gRNA靶向同一个基因，看是否具有一致的表型。
- 使用对应mRNA回救相应基因的敲除。
Generation of biallelic F0 mutants in medaka using the CRISPR/Cas9 system
- Cas9蛋白-crRNA-tracrRNA复合物
- 同时使用两个sgRNA，进行片段删除：470bp和960bp
- 脱靶检测：在线预测软件Match-CRISPR
A simple and effective F0 knockout method for rapid screening of behaviour and other complex phenotypes
- 高效在斑马鱼胚胎敲除，在F0即可获得纯合突变（90%的胚胎）；实现了多基因敲除
- RNPs注射，使用3个RNP靶向同一个基因即能够取得较高（90-95%）的biallelic突变，再增加RNP提升效果不大，同时，胚胎的存活率在可接受的范围（>75%）